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超低溫冰箱在高山冰緣植物抗凍蛋白分離的應(yīng)用

點擊次數(shù):2425    更新時間:2017-05-04

   抗凍蛋白zui早在南極魚類中發(fā)現(xiàn),是一類能夠抑制冰晶生長的特殊蛋白.由于抗凍蛋白分布的不普遍性,很難從特定幾種植物中找到,并且傳統(tǒng)的質(zhì)外體提取技術(shù)難掌握。

   先將液氮保存的高山冰緣植物葉片高山紅景天、高山早熟禾、高山離子芥、株芽蓼利用液氮進行研磨,研磨得到的粉末用PH8.0磷酸緩沖液混勻,并12000g離心10分鐘,取上清,此為可溶性蛋白粗提液,將45毫升粗提液放入50毫升小燒杯5在層析冷柜低溫4℃保存待用。用高壓氮氣通過減壓閥門20.1兆帕壓力順導(dǎo)管3流經(jīng)液氮進行探頭預(yù)冷,探頭浸入含蛋白粗提液的50毫升小燒杯5進行凍冰吸附,內(nèi)放轉(zhuǎn)子進行磁力攪拌保持溶液均勻。

  當(dāng)燒杯內(nèi)液面下降5毫升后取出凍冰探頭7,室溫融化冰晶,補加磷酸緩沖液至45毫升,重復(fù)用探頭凍冰吸附一次。第二次凍冰的冰晶室溫融化,利用截流量5000道爾頓的透析袋在無離子水中脫鹽12小時,每隔2小時換水,脫鹽后透析袋埋入PEG8000的粉末中濃縮。濃縮后的蛋白溶液用用考馬斯亮藍G250比色法測定濃度,用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線。將定量后的蛋白用20%蔗糖溶液稀釋成1mg/L5mg/L濃度,滴加到一載玻片,覆蓋一蓋玻片壓成均勻液膜。將制片放入上海田楓-70℃超低溫冰箱內(nèi)30分鐘凍冰后,通過塑料泡沫板13操作入口迅速將制片11放到顯微鏡9載物臺,通過照相目鏡子10操作觀察口觀察中向蓋玻片上加一滴二甲苯,100倍油鏡觀察,調(diào)整視野,重結(jié)晶15分鐘后放上照相機照相記錄,發(fā)現(xiàn)高山離子芥和株芽蓼具有抑制重結(jié)晶的活性.

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